流式細胞術檢測和計數細菌之多種革蘭氏陽性細菌的表征分析
 
 微生物檢測和計數已應用于多種研究領域，如環境監控等。流式細胞術為鑒定和計數不同基質中各種不同種屬細菌提供了可能。通過合適的染色將背景區別開，以低上樣次數并以極快的速度進行計數。現有測定法也可快速進行檢測，但準確度較低（例如比濁法），或通過比較法以很慢的速度進行檢測（CFU―菌落形成單位，通常情況下，通過培養并測定菌落數需要花費48 個小時），并可能需要進行連續稀釋，以覆蓋廣泛的潛在濃度。相比之下，FCM（流式細胞術）能夠在1 分鐘以內即可得出結果。
 
 本文介紹了使用CytoFLEX流式細胞分析儀對多種革蘭氏陽性細菌進行表征分析。在此有三點相關說明：第一，此文實驗考察了多種革蘭氏陽性細菌；第二，對八種有代表性的革蘭氏陽性細菌樣本和陰性對照樣品進行了比較，涵蓋了不同細菌種屬包括球菌和桿菌，并測試了CytoFLEX 儀器對細菌檢測和計數的能力；第三，顯示了多種（6 種對數標度）濃度和流速范圍內的計數線性
 
 革蘭氏陽性細菌包含多種有經濟意義的細菌屬：通常因為其具有致病性，可導致食品污染（例如，單核細胞增多性李斯特氏菌等），或與疾病和感染有關（例如，葡萄球菌和鏈球菌等）。
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 標準流程
 在進行CytoFLEX 分析前需要進行樣本前處理，將每種待檢測的細菌培養基用PBS 重懸并利用比濁法（光密度法）檢測細菌濃度，將濃度調整至0.5McFarland 單位（麥氏濁度單位），或150 x 106mL-1 的菌濃度，將這個濃度標記為[1x]。取出兩份樣品，使用PBS 進一步稀釋10 倍和100 倍，分別為15 或 1.5 x 103 μL-1 的菌濃度。
 
 對未染色樣本和利用核酸染料SYTO（一種具有核酸著染性的活體染料混合物）進行標記的樣本進行流式檢測（SYTO BC 試劑盒由Thermo Fischer Scientific 公司提供）。根據生產商提供的使用說明來使用染料：1 mL 樣品用1 μL 儲存原液（溶于DMSO）進行染色，但實驗中發現這種染色方案會導致明顯的二次著染。通過以1：1000 比例稀釋儲備原液（將1 μL 原始儲備液加入1 mL PBS）得到二級儲備液，然后以1：100 的稀釋比例作為工作濃度進行染色（5 μL/500 μL 小份樣品，或1% 的建議濃度），就能得出很好的染色效果
 
 儀器配置
 本實驗僅需要利用藍色激光來進行前向和側向散射光的分析（FSC 和SSC）， 并利用FITC 通道測定綠色SYTO 熒光，所以本試驗可使用任何配置的CytoFLEX 進行分析。
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 數據獲取設置
 一般情況下，細菌比大多數真核細胞要小，因此，在利用流式分析細菌時我們需要對CytoFLEX 默認的FSC （前向散射）和SSC（側向散射）信號增益進行設置。熒光通道增益設置在正常范圍內。
 通過在固定檢測流速內進行固定時間的數據獲取，可以得到固定的檢測體積，并更簡單明了地減去任何背景計數。
 比如，進行初步表征分析時，以10 μL/ 分鐘（低）流速，時間為30 秒，因此，固定的體積為5 μL/ 樣品。
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 以下一系列流式圖均顯示未設門密度圖并用兩個散射光的對數表示，并用一個通用的門對細菌進行圈門（品紅色）。除了對照外，本分析圖均顯示了未染色樣品圖。
 第二個流式圖是將SYTO 陽性群進行設門的散射光對數圖，但這個散點圖利用一個藍色的門對細菌進行圈門。根據SYTO 陽性群，將第二個區域定義為“活的”（藍色）。
 最后一個散點圖是綠色（SYTO）熒光通道FITC 的單一參數疊加直方圖，可比較未標記的和標記的細菌樣品比例差別，并將“SYTO+”區域用于對第二個圖進行設門。
 
 注：
 即使在SYTO 染料濃度較低（低至建議濃度的1%）的情況下進行檢測，如果在檢測了染色樣品后緊接著檢測未染色的（陰性對照）樣品，我們需要對管路進行沖洗，防止污染。我們可以在樣品數據獲取過程中使用SYTO 熒光對時間的散點圖來進行監測。據推測，產生這種情況的原因是染料吸附在進樣管內，然后在后續的上樣過程中染料被釋放出來而造成污染。可按樣品上樣方式運行一份小體積次氯酸鈉稀釋液（10%），并使用蒸餾水進行沖洗，可有效控制這個問題。
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 時間進程QC 顯示SYTO- 標記的陽性樣本（上圖），顯示由于染料吸附在管路上和釋放導致的劇烈時程標記的陰性對照，以及樣品管線清潔后的正確陰性對照（下圖）。
 
 本應用說明中顯示的結果僅代表在貝克曼庫爾特 CytoFLEX 流式細胞儀上產生的結果。由于分析儀之間存在性能差異，因此，作者不能保證使用其他的流式細胞儀可得出相似的結果。
 
 試劑詳情
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 * CytoFLEX 流式細胞儀僅用于科學研究，不用于臨床診斷。